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🧬 DNBelab C Series HT scRNA 分析流程

单细胞 RNA 测序数据分析完整指南

📋 概述 • 📁 文件准备 • 📊 参考数据库 • 🚀 主流程分析 • 📊 结果解析

📋 概述

本文档旨在提供一份完整的指南，详细介绍如何使用 dnbc4tools 对单细胞 RNA 测序数据进行分析。

工作流程：原始数据 → 质量控制 → 比对 → 细胞识别 → 表达矩阵 → 分析报告

💡 使用说明：$dnbc4tools 代表可执行程序路径，需替换为您的实际安装路径。换行符 `\` 用于在命令行中将命令分为多行，以提高可读性。

📁 文件准备

分析需要两种类型的 FASTQ 文件：

文件类型	说明
cDNA 文库	包含 Cell Barcode、UMI 和转录组信息的测序数据。
Oligo 文库	包含大小磁珠的 Cell Barcode 信息及小磁珠的 UMI 信息。

⚠️ 注意：请确保 FASTQ 文件质量良好，并记录文件路径以备后续分析使用。

📊 参考数据库

文件要求

文件类型	格式	说明
基因组文件	FASTA	包含特定物种的完整基因组序列（通常是主装配版本），涵盖染色体、线粒体及其他遗传信息。该文件是基因组比对和分析的基础。
注释文件	GTF	详细描述基因组中的基因、转录本、外显子等功能区域。此文件明确了基因的位置、类型及相关属性。

💡 推荐数据来源：优先使用 [Ensembl 数据库](https://www.ensembl.org/index.html)提供的文件。Ensembl 的 GTF 文件包含可选标签，便于通过 $dnbc4tools tools mkgtf 进行过滤。

GTF 文件要求：

必须包含 gene 或 transcript 类型以及 exon 类型的注释。
属性中必须包含 gene_id 或 gene_name 以及 transcript_id 或 transcript_name。
不支持 GFF 文件格式。
基因组文件与注释文件需版本对应。

GTF 文件处理（可选）

从 ENSEMBL 和 UCSC 等网站下载的 GTF 文件通常包含多种类型的基因。根据您的研究兴趣选择特定的基因类型进行分析，可以有效减少基因注释的重叠，从而提高比对的唯一性。与多个基因非唯一比对的 reads 会被过滤。

我们提供以下三种 GTF 文件处理功能：

功能	说明
基因类型统计	统计 GTF 文件中各基因类型的数量。
GTF 文件校正	填补缺失信息，确保 GTF 文件符合分析要求。
基因类型过滤	根据研究需要筛选特定基因类型。

基因类型统计

# 统计基因类型数量
$dnbc4tools tools mkgtf \
  --action stat \
  --ingtf genes.gtf \
  --output gtfstat.txt \
  --type gene_biotype

⚠️ 注意：需要查看 GTF 文件中的 tag 确定 type 的类型。

输出示例：

$cat gtf_type.txt
Type    Count
protein_coding  20006
lncRNA  17755
processed_pseudogene    10159
unprocessed_pseudogene  2605
misc_RNA        2221
snRNA   1910
miRNA   1879
TEC     1056
transcribed_unprocessed_pseudogene      950
snoRNA  943
transcribed_processed_pseudogene        503
rRNA_pseudogene 497
IG_V_pseudogene 187
transcribed_unitary_pseudogene  146
IG_V_gene       145
......

GTF 文件校正

当 GTF 文件内容不完整时，主分析流程可能会因无法完全注释而中断。此功能能够自动填补基因（gene）与转录本（transcript）条目中的缺失信息，确保流程顺利进行。

# 校正GTF文件
$dnbc4tools tools mkgtf \
  --action check \
  --ingtf genes.gtf \
  --output corrected.gtf

软件会根据 gene_id 和 gene_name 以及 transcript_id 和 transcript_name 互相填补，并提示可能存在多个基因信息的位置。

基因类型过滤

# 基因类型过滤
$dnbc4tools tools mkgtf \
  --ingtf genes.gtf \
  --output genes.filter.gtf \
  --type gene_biotype

默认包含的基因类型：

protein_coding
lncRNA/lincRNA
antisense
IG_V_gene
IG_LV_gene
IG_D_gene
IG_J_gene
IG_C_gene
IG_V_pseudogene
IG_J_pseudogene
IG_C_pseudogene
TR_V_gene
TR_D_gene
TR_J_gene
TR_C_gene

您也可以使用 include 参数自定义需要保留的基因类型：

# 自定义基因类型过滤
$dnbc4tools tools mkgtf \
  --ingtf genes.gtf \
  --output genes.filter.gtf \
  --type gene_biotype \
  --include protein_coding,lncRNA,lincRNA,\
        antisense,IG_V_gene,IG_LV_gene,IG_J_gene,\
        IG_C_gene,IG_V_pseudogene,IG_J_pseudogene,\
        IG_C_pseudogene,TR_V_gene,TR_D_gene,TR_J_gene,TR_C_gene

构建参考数据库

在执行 dnbc4tools rna run 分析前，必须先构建参考数据库。此步骤利用注释文件（GTF）和参考基因组（FASTA）创建索引，用于后续测序 reads 的比对和注释。

# 构建参考数据库
$dnbc4tools rna mkref \
  --fasta genome.fa \
  --ingtf genes.gtf \
  --species Homo_sapiens \
  --threads 10

输出结果：

成功运行后，将在指定位置创建参考数据库目录，包含以下文件结构：

/opt/database/Homo_sapiens
├── fasta
│   ├── genome.fa
│   └── genome.fa.fai
├── genes
│   └── genes.gtf
├── ref.json
└── star
    ├── chrLength.txt
    ├── chrNameLength.txt
    ├── chrName.txt
    ├── chrStart.txt
    ├── exonGeTrInfo.tab
    ├── exonInfo.tab
    ├── geneInfo.tab
    ├── Genome
    ├── genomeParameters.txt
    ├── mtgene.list
    ├── SA
    ├── SAindex
    ├── sjdbInfo.txt
    ├── sjdbList.fromGTF.out.tab
    ├── sjdbList.out.tab
    └── transcriptInfo.tab

其中 ref.json 文件记录了数据库的主要信息。

{
    "chrmt": "chrM",
    "genome": "/opt/database/Homo_sapiens/fasta/genome.fa",
    "genomeDir": "/opt/database/Homo_sapiens/star",
    "gtf": "/opt/database/Homo_sapiens/genes/genes.gtf",
    "input_fasta_files": [
        "genome.fa"
    ],
    "input_gtf_files": [
        "genes.filter.gtf"
    ],
    "mtgenes": "/opt/database/Homo_sapiens/star/mtgene.list",
    "species": "Homo_sapiens",
    "version": "dnbc4tools 3.0"
}

⚠️ 注意：构建参考数据库可能需要较长时间，具体取决于基因组大小和计算性能。软件主分析流程兼容旧版本数据库。

运行时将打印如下信息：

2025-11-12 15:56:12 Creating new reference folder at /opt/database/Homo_sapiens
...done

 2025-11-12 15:56:12 Writing genome FASTA file into reference folder...                             
...done

 2025-11-12 15:56:14 Indexing genome FASTA file...                                                  
...done

 2025-11-12 15:56:15 Writing genes GTF file into reference folder...                                
...done

 2025-11-12 15:57:11 Generating STAR genome index...                                                
...done

 2025-11-12 15:59:29 Writing Reference JSON file into reference folder...                           
...done
Analysis Complete

🚀 主流程分析

多样本批处理（可选）

为简化多样本分析流程，您可以使用配置文件批量生成针对每个样本的 shell 脚本。

$dnbc4tools rna multi \
  --list sample.tsv \
  --genomeDir /opt/database/Homo_sapiens \
  --threads 30

其中 sample.tsv 文件使用制表符 (\t) 分隔，包含三列：

列	内容
1	样本名称
2	cDNA 文库测序数据
3	Oligo 文库测序数据

⚠️ 注意：多个 fastq 文件以逗号分隔，R1 和 R2 文件以分号分隔。

sample1	/data/cDNA1_R1.fq.gz;/data/cDNA1_R2.fq.gz	/data/oligo1_R1.fq.gz,/data/oligo4_R1.fq.gz;/data/oligo1_R2.fq.gz,/data/oligo4_R2.fq.gz
sample2	/data/cDNA2_R1.fq.gz;/data/cDNA2_R2.fq.gz	/data/oligo2_R1.fq.gz;/data/oligo2_R2.fq.gz
sample3	/data/cDNA3_R1.fq.gz;/data/cDNA3_R2.fq.gz	/data/oligo3_R1.fq.gz;/data/oligo3_R2.fq.gz

运行完成后，将为每个样本生成一个 shell 脚本：

sample1.sh
sample2.sh
sample3.sh

sample1.sh 文件内容示例：

$cat sample1.sh
/opt/software/dnbc4tools3.0beta/dnbc4tools rna run --name sample1 --cDNAfastq1 /data/cDNA1_R1.fq.gz --cDNAfastq2 /data/cDNA1_R2.fq.gz --oligofastq1 /data/oligo1_R1.fq.gz,/data/oligo4_R1.fq.gz --oligofastq2 /data/oligo1_R2.fq.gz,/data/oligo4_R2.fq.gz --genomeDir /database/scRNA/Mus_musculus/mm10 --threads 30

随后，您可以执行这些脚本以进行主流程分析。

单样本分析

RNA 主分析流程处理单个样本的 cDNA 和 Oligo 文库测序数据。该流程的核心步骤包括：

数据处理：执行质量控制、比对和功能区域注释。
细胞识别：合并磁珠，识别有效细胞。
矩阵生成：生成原始及过滤后的基因表达矩阵。
高级分析：对过滤后矩阵进行细胞筛选、降维、聚类和注释。
报告生成：输出 HTML 格式的分析报告及其他结果文件。

为单个样本生成表达矩阵的示例脚本：

$dnbc4tools rna run \
		--name sample \
		--cDNAfastq1 /data/sample_cDNA_R1.fastq.gz \
		--cDNAfastq2 /data/sample_cDNA_R2.fastq.gz \
		--oligofastq1 /data/sample_oligo1_1.fq.gz,/data/sample_oligo2_1.fq.gz \
		--oligofastq2 /data/sample_oligo1_2.fq.gz,/data/sample_oligo2_2.fq.gz \
		--genomeDir /opt/database/Homo_sapiens \
		--threads 30

在对试剂版本和暗反应自动检测后，软件开始运行分析，以下是一个示例：

──────────────────────────── Parsed FASTQ Inputs — 2025-11-12 15:00:24 ─────────────────────────────
┌─────────────┬────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐
│ Type        │ Path                                                                               │
├─────────────┼────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┤
│ cDNA Read1  │ /data/test_cDNA_R1.fastq.gz                                                        │
│ cDNA Read2  │ /data/test_cDNA_R2.fastq.gz                                                        │
│ oligo Read1 │ /data/test_oligo_1_R1.fastq.gz                                                     │
│ oligo Read2 │ /data/test_oligo_2_R2.fastq.gz                                                     │
└─────────────┴────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘
────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────


──────────────────────────── Chemistry Detection — 2025-11-12 15:00:31 ─────────────────────────────
┌───────────────────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────────────────┐
│ Type                                          │ Result                                           │
├───────────────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────────────────┤
│ oligo Read1                                   │ darkreaction                                     │
│ oligo Read2                                   │ darkreaction                                     │
└───────────────────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────────────────┘
────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────


──────────────────────────── Chemistry Detection — 2025-11-12 15:00:31 ─────────────────────────────
┌─────────────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────────────────────┐
│ Type                                        │ Result                                             │
├─────────────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────────────────────┤
│ cDNA Read1                                  │ darkreaction                                       │
└─────────────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────────────────────┘
────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────

 2025-11-12 15:00:31 Starting oligo library filtering...                                            
...done

 2025-11-12 15:05:53 Starting cDNA library filtering...                                             
...done

 2025-11-12 15:07:49 Performing read alignment and UMI counting...                                  
...done

 2025-11-12 15:15:25 Calculating bead similarity and merging beads within droplets...               
...done

 2025-11-12 15:15:41 Generating raw gene expression matrix...                                       
...done

 2025-11-12 15:17:24 Generating cell-filtered gene expression matrix...                             
...done

 2025-11-12 15:17:43 Calculating sequencing saturation metrics...                                   
...done

 2025-11-12 15:18:08 Generating position-sorted BAM file...                                         
...done

 2025-11-12 15:24:46 Performing dimensionality reduction and clustering analysis...                 
...done

 2025-11-12 15:27:21 Generating analysis report and summary statistics...                           
...done

Analysis Finished Elapsed Time: 0:28:56

当出现 Analysis Finished 消息时，表示分析已成功完成。

📊 结果解析

分析完成后，将生成 outs（结果输出）和 logs（日志）目录。outs 目录结构如下：

. 
├── analysis/
│   ├── cluster.csv
│   ├── marker.csv
│   └── QC_Cluster.h5ad
├── anno_decon_sorted.bam
├── anno_decon_sorted.bam.bai
├── filter_feature.h5ad
├── filter_matrix/
│   ├── barcodes.tsv.gz
│   ├── features.tsv.gz
│   └── matrix.mtx.gz
├── metrics_summary.xls
├── raw_matrix/
│   ├── barcodes.tsv.gz
│   ├── features.tsv.gz
│   └── matrix.mtx.gz
├── *_scRNA_report.html
└── singlecell.csv

相关文档：

❓ 常见问题

内容待补充