🧬 DNBelab C Series HT scATAC 分析流程

单细胞 ATAC 测序数据分析完整指南

📋 概述 • 📁 文件准备 • 📊 参考数据库 • 🚀 主分析流程 • 📊 结果解析

📋 概述

本文档详细介绍了使用 dnbc4tools 进行单细胞 ATAC 测序数据分析的完整流程。

工作流程：原始数据 → 质量控制 → 比对 → 磁珠合并 → Peak调用 → 细胞识别 → 降维聚类 → 分析报告

💡 使用说明：$dnbc4tools 代表可执行程序路径，使用时需要替换为实际安装路径。换行符 `\` 用于在命令行中将命令分为多行，以提高可读性。

📁 文件准备

分析需要FASTQ文件：

文件类型	说明
ATAC文库	包含cell barcode和染色质开放区域信息的测序数据

⚠️ 注意：确保FASTQ文件质量良好，并记录好文件路径，用于后续分析。

📊 参考数据库

文件要求

文件类型	格式	说明
基因组文件	FASTA	包含特定物种的完整基因组序列，包括染色体、线粒体及其他遗传信息，通常为主装配版本。这些文件为基因组分析和比对提供基础数据。
注释文件	GTF	包含基因组中基因、转录本、外显子及其他功能区域的详细信息。该文件标识基因的位置、类型及其相关属性。

💡 推荐数据来源：优先使用[Ensembl数据库](https://www.ensembl.org/index.html)提供的文件。Ensembl的GTF文件包含可选标签，便于过滤（通过dnbc4tools tools mkgtf）。

GTF文件要求：

必须包含gene或transcript类型的注释
不支持GFF文件格式
基因组文件与注释文件需对应

GTF文件处理（可选）

有关GTF文件过滤的详细信息，请参考scRNA分析流程。

构建参考数据库

在运行dnbc4tools atac run分析之前，我们需要优先构建参考数据库。此步骤需要注释文件(GTF)和参考基因组(FASTA)来构建索引文件，用于测序reads的比对和统计分析。

$dnbc4tools atac mkref \
  --fasta genome.fa \
  --ingtf genes.gtf \
  --species Mus_musculus

输出结果：

成功运行后，将在指定位置创建参考数据库目录，包含以下文件结构：

/opt/database/Mus_musculus
├── fasta
│   ├── genome.fa
│   ├── genome.fa.fai
│   ├── genome.index
│   └── genome.index.log
├── genes
│   └── genes.gtf
├── ref.json
└── regions
    ├── chrom.sizes
    ├── promoter.bed
    └── tss.bed

其中ref.json文件中记录数据库的主要信息：

{
    "species": "Mus_musculus",
    "input_fasta_files": [
        "genome.fa"
    ],
    "input_gtf_files": [
        "genes.gtf"
    ],
    "genome": "/opt/database/Mus_musculus/fasta/genome.fa",
    "index": "/opt/database/Mus_musculus/fasta/genome.index",
    "gtf": "/opt/database/Mus_musculus/genes/genes.gtf",
    "chrmt": "chrM",
    "chloroplast": "None",
    "chromeSize": "/opt/database/Mus_musculus/regions/chrom.sizes",
    "tss": "/opt/database/Mus_musculus/regions/tss.bed",
    "promoter": "/opt/database/Mus_musculus/regions/promoter.bed",
    "version": "dnbc4tools 3.0",
    "blacklist": "None",
    "genomesize": "mm"
}

⚠️ 注意：构建参考数据库可能需要较长时间，取决于基因组大小和计算机性能。软件主分析流程兼容旧版本数据库。

运行时打印信息，以下是一个示例：

 2025-11-12 16:13:32 Creating new reference folder at /opt/database/Mus_musculus      
...done

 2025-11-12 16:13:32 Writing genome FASTA file into reference folder...                             
...done

 2025-11-12 16:13:33 Indexing genome FASTA file...                                                  
...done

 2025-11-12 16:13:34 Writing genes GTF file into reference folder...                                
...done

 2025-11-12 16:13:38 Extracting TSS and promoter regions from GTF file...                           
...done

 2025-11-12 16:13:42 Generating Chromap genome index...                                             
...done

 2025-11-12 16:14:07 Writing reference JSON file...                                                 
...done
Analysis Complete

🚀 主分析流程

多样本批处理（可选）

为了简化每个样本单独生成主分析流程，可以使用配置文件来生成一个包含多个样本的主流程 shell 脚本。以下是一个示例步骤或脚本模板：

$dnbc4tools atac multi \
  --list sample.tsv \
  --genomeDir /opt/database/Mus_musculus \
  --threads 10

其中 sample.tsv 文件使用制表符 (\t) 分隔，包含两列：

列	内容
1	样本名称
2	文库测序数据

⚠️ 注意：多个fastq文件以逗号（`,`）分隔， R1和R2文件以分号（`;`）分隔

sample1	/data/sample1_R1.fq.gz;/data/sample1_R2.fq.gz
sample2	/data/sample2_R1.fq.gz;/data/sample2_R2.fq.gz
sample3	/data/sample3_1_R1.fq.gz,/data/sample3_2_R1.fq.gz;/data/sample3_1_R2.fq.gz,/data/sample3_2_R2.fq.gz

运行完成后输出：

sample1.sh
sample2.sh
sample3.sh

其中文件 sample1.sh 如下：

$cat sample1.sh
/opt/software/dnbc4tools3.0Beta/dnbc4tools atac run --name sample1 --fastq1 /data/sample1_R1.fq.gz --fastq2 /data/sample1_R2.fq.gz --genomeDir /opt/database/Mus_musculus --threads 10

执行第四步进行主流程分析。

单样本分析

ATAC 主分析流程使用单个样本单细胞 ATAC 文库测序数据，经过过滤和比对生成所有磁珠的 fragments 文件。合并磁珠并执行 peak 调用分析，利用 peaks 区域的片段信息进行细胞识别。随后进行细胞过滤、降维和聚类，最终整合各步骤结果生成 HTML 网页报告并输出分析结果。

为单个样本生成表达矩阵，以下是一个示例步骤或脚本模板：

$dnbc4tools atac run \
  --name sample \
  --fastq1 /sample/data/test1_R1.fastq.gz,/sample/data/test2_R1.fastq.gz \
  --fastq2 /sample/data/test1_R2.fastq.gz,/sample/data/test2_R2.fastq.gz \
  --genomeDir /opt/database/Mus_musculus \
  --threads 10

在对试剂版本和暗反应自动检测后，软件开始运行分析，以下是一个示例：

──────────────────────────── Parsed FASTQ Inputs — 2025-11-12 15:05:39 ─────────────────────────────
┌───────┬──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐
│ Type  │ Path                                                                                     │
├───────┼──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┤
│ Read1 │ /data/test_ATAC_R1.fastq.gz                                                              │
│ Read2 │ /data/test_ATAC_R2.fastq.gz                                                              │
└───────┴──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘
────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────


──────────────────────────── Chemistry Detection — 2025-11-12 15:05:49 ─────────────────────────────
┌─────────────────────────────────┬────────────────────────────────────────────────────────────────┐
│ Type                            │ Result                                                         │
├─────────────────────────────────┼────────────────────────────────────────────────────────────────┤
│ Read1                           │ darkreaction                                                   │
│ Read2                           │ darkreaction                                                   │
└─────────────────────────────────┴────────────────────────────────────────────────────────────────┘
────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────

 2025-11-12 15:05:49 Performing raw data quality control and alignment...                           
...done

 2025-11-12 15:24:56 Calculating bead similarity and merging beads within droplets...               
...done

 2025-11-12 15:28:00 Processing fragments for peak calling...                                       
...done

 2025-11-12 15:31:22 Generating raw peak count matrix...                                            
...done

 2025-11-12 15:38:18 Generating cell-filtered peak count matrix...                                  
...done

 2025-11-12 15:43:23 Performing dimensionality reduction and clustering...                          
...done

 2025-11-12 15:50:03 Generating analysis report and summary statistics...                           
...done

Analysis Finished Elapsed Time: 0:44:41

成功的运行会以 Analysis Finished 结束。

📊 结果解析

分析完成后，将生成结果输出目录outs，logs日志目录。

. 
├── *_scATAC_report.html
├── filter_peak_matrix/
│   ├── barcodes.tsv.gz
│   ├── matrix.mtx.gz
│   └── peaks.bed.gz
├── fragments.tsv.gz
├── fragments.tsv.gz.tbi
├── metrics_summary.xls
├── raw_peak_matrix/
│   ├── barcodes.tsv.gz
│   ├── matrix.mtx.gz
│   └── peaks.bed.gz
└── singlecell.csv

相关文档：

❓ 常见问题

内容待补充